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普洱茶发酵过程中外源接种黄曲霉产毒研究
作者:   信息来源: 听茶自己说话 数字云茶   发布时间:2017/9/11 15:31:20

 
   “普洱茶产黄曲霉致癌说”让消费者对普洱茶安全性引发争议,而试验结果表明,在普洱茶发酵过程中,接种的黄曲霉能在茶叶中生长繁殖,但随发酵时间的延长,黄曲霉在茶叶中的生长明显受到抑制,其数量逐渐下降。发酵终止时,未在茶样中检测出黄曲霉毒素。

                                




  黄曲霉毒素是真菌的次级代谢产物,主要由黄曲霉、寄生曲霉和集蜂曲霉等菌株产生,是世界公认的三大强致癌物质之一,是一种剧毒物质。所以,食品中若有黄曲霉毒素存在,就会极大地威胁着消费者的健康。黄曲霉是粮食和食品中最常见的真菌,但并非所有黄曲霉菌株都能产生毒素,据Smith、Aquire等人报道,从自然界中分离的黄曲霉菌株中,只有10%能产毒素。

  黄曲霉毒素的污染主要是由于储存条件不当造成的,如仓储温度高、湿度大、通风透气条件不良等。由于普洱茶的发酵和仓储存在高温、高湿的特殊性,人们对普洱茶是否会受到黄曲霉污染并产生致癌物质存有疑虑。

                             

  2003年,台湾孙璐西将黄曲霉接种于云南晒青毛茶,进行模拟普洱茶渥堆试验,以验证普洱茶在受到黄曲霉污染的情况下是否产毒。试验发现,接种黄曲霉的毛茶中只有灭过菌的A组检出黄曲霉毒素(1.05μg·kg-1),且其量低于标准,其余B及C组皆未检出黄曲霉毒素。

  2011年,徐丹等研究了黑曲霉对黄曲霉生长、产毒的抑制作用,发现黑曲霉既能抑制黄曲霉生长、产毒,又能降解AFTB1。

  陈建玲等抽取了70份湿仓储存普洱茶样本,检测黄曲霉毒素B1、伏马毒素(Fumonisin B1,FB1)、呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇,deoxynivalenol,DON)和T-2毒素的浓度,结果表明,湿仓储存普洱茶存在真菌毒素AFB1及DON不同程度的污染。


  以云南大叶种晒青茶为原料,接种产毒黄曲霉进行模拟普洱茶发酵试验,并在发酵结束时通过LC-MS/MS法对茶样进行黄曲霉毒素检测,研究普洱茶发酵过程中黄曲霉的生长及产毒情况,为普洱茶生产安全、质量安全及饮用安全提供理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料
  茶样:2011年云龙晒青毛茶。
黄曲霉(A. flavus)菌株:引自云南省微生物研究所。YM 31880,来源于ATCC(美国菌种保藏中心);YM 31882,来源于AS(中国科学院微生物研究所)。两株菌均能产黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2。

  1.2 仪器设备
   SW-CJ-1CU洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、ZHWY-2102摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)、YXQ-SG41-280电热手提压力蒸汽消毒器(上海医用核子仪器厂)、TEMI880恒温恒湿箱(上海一恒科学仪器有限公司)、101-3ABS恒温电热干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)、API3200 LC/MS/MS高效液相色谱串联质谱仪(美国AB公司)、LC-20ADXR液相色谱仪(日本岛津)、N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司)。

  1.3 试验方法

  1.3.1 模拟发酵试验
  发酵条件为环境湿度70%,潮水量35%,接种量5%(茶叶20 g,菌液1 mL),温度37℃,每7 d定期翻堆,取样进行菌落计数并观察微生物形态特征。发酵结束时取出堆样,用LC-MS/MS法定性定量检测。试验处理见表1。

                                                           


  1.3.2 LC-MS/MS法
  黄曲霉毒素检测方法参照文献[16-17]进行改进。

  取2.0 g混合均匀并捣碎的茶叶末于25 mL具塞比色管中,加1%盐酸溶液∶乙腈=3∶7的提取液15 mL,旋涡混匀后超声30 min,过滤,取滤液备用。

  取滤液10 mL于多功能净化柱配套的试管内,缓慢压下多功能净化柱,保持1 mL·min-1的速度,完全压至试管底部,取净化后的提取液5 mL于10 mL比色管中,在40℃的温度下氮吹至尽干,用水∶甲醇=2∶8的溶液1 mL洗涤残渣,振荡混匀,用0.22 μm滤膜针头滤器过滤,滤液待测。

  色谱条件:色谱柱为美国Waters公司Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。流动相A为水,流动相B为甲醇。

  质谱条件:扫描方式为电喷雾正离子模式(ESI+);检测方式为多反应监测(MRM);喷雾电压5 500 V;气帘气30 kPa;碰撞气55 kPa;脱溶剂温度600℃;雾化气10 kPa;辅助气60 kPa。多反应检测条件见表2。

                                

  2 结果与分析

  2.1 黄曲霉菌种在PDA斜面上的生长状况
将保存的黄曲霉菌种YM 31880和YM 31882转接至PDA斜面上,28℃恒温培养,每隔3 d观察菌种生长状况,生长6 d后比较PDA斜面上菌种生长状况。如图1与图2所示,培养6 d后,YM 31880菌种在PDA斜面上生长出较多黑色菌核,菌落呈橘红色,气生菌丝稀少,孢子呈黄绿色;YM 31882菌种的气生菌丝生长旺盛,菌落呈黄绿色,有黑色菌核,孢子呈黄绿色。

                                


   2.2 菌种在发酵茶叶中的生长状况
   图3为接种菌株发酵4 d后的茶样。发酵初期,黄曲霉在茶叶中生长较快,至发酵4 d时,茶叶中已有大量的黄曲霉生长(图3-A、3-B、3-D、3-E),但到8 d以后长势变弱;而对照组(图3-C,3-F)中未发现黄曲霉菌种生长。

                                  


  2.3 计数结果
  在发酵过程中接入产黄曲霉毒素菌株 (YM31880和YM31882),发酵过程中菌株的生长变化情况见表3。由表3可知:原料茶均未检测到黄曲霉菌种,且在发酵过程中C、F两个对照组自始至终均未发现有黄曲霉菌种生长,而接种黄曲霉孢悬液的茶样中均检测到菌种。两株菌在接种后开始生长繁殖,随着发酵的进行,菌种数量在发酵8 d时达到最高,之后呈下降趋势。灭菌接种组(A、B)整体比未灭菌接种组(D、E)的黄曲霉菌种数量多,可能是由于灭菌组未受到原料茶中其他微生物的竞争抑制,而未灭菌组由于受到原料茶中微生物(尤其是优势菌种)的竞争抑制,黄曲霉菌生长态势较灭菌组弱,其中D组(未灭菌,接种YM 31880)在发酵第22 d时,黄曲霉菌数下降至0。

                                 


  2.4发酵茶样中霉菌的变化
  研究表明,黑曲霉是普洱茶发酵过程中的优势菌种[18]。实验对选取黑曲霉与黄曲霉进行对比,两者在发酵过程中的数量变化见表4。由表中可知,未经灭菌茶样(D、E)在发酵过程中,黄曲霉和黑曲霉的生长都呈先迅速增长而后逐渐下降的趋势。黄曲霉在发酵初期的生长态势优于黑曲霉,但到发酵后期,黑曲霉作为优势菌种,其生长强于黄曲霉,说明两者之间存在竞争抑制作用。而对照(F)自始至终没有黄曲霉,黑曲霉生长则呈先增后降的趋势。说明普洱茶的发酵是以微生物为主导的固态发酵过程,发酵系统中存在多种微生物,但未受外源黄曲霉污染时,发酵过程中不会有黄曲霉菌生长。

                                

  2.5 发酵茶样中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2检测

  2.5.1 黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的标准曲线和检测限

  对质量浓度为0.5、1、2、5、10 μg·L-1的标准混合溶液,以峰面积(Y)对质量浓度(X,μg·kg-1)进行线性回归,得到标准曲线。4种黄曲霉毒素的标准曲线、相关系数及检出限列于表5。结果表明,4种黄曲霉毒素的线性关系良好。
                                  

                                  


  2.5.2 发酵茶样中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2检测
  选取A、B、C、D、E、F各组发酵出堆样品,用LC-MS/MS法检测黄曲霉毒素情况,结果见表6。由表6可知,原料灭菌接种产毒黄曲霉YM 31880和YM 31882的A、B处理,在发酵终止时虽有黄曲霉但不产毒;原料未灭菌接种产毒黄曲霉YM 31880的D处理在发酵结束时未检测到黄曲霉,也未检测到黄曲霉毒素;原料未灭菌接种产毒黄曲霉YM 31882的E处理,在发酵终止时有黄曲霉但不产毒。各处理的黄曲霉毒素检出率均为0。对照组C、F茶样中未检测到黄曲霉毒素。实验结果表明,普洱茶发酵过程中,未受外源黄曲霉污染的情况下,不会有黄曲霉生长;在受外源黄曲霉污染的情况下,会有黄曲霉生长,但茶叶中无黄曲霉毒素。原因是以茶叶为基质的发酵环境不利于黄曲霉产毒,还是所产毒素在发酵过程中被分(降)解,有待进一步研究。

                                  

  3 小结与讨论
  3.1 LC-MS/MS法适用于茶叶中黄曲霉毒素的检测
  LC-MS/MS法具有选择性较强、重现性好、稳定性高的特点,对茶叶这种成分复杂的样品能在一定程度上减小基质效应的影响,进而有效地避免假阳性或者假阴性结果。该方法可为今后学科的进一步深入研究提供理论基础。

  3.2 晒青原料作为基质不利于黄曲霉的生长及产毒
  人们生活的很多环境中都存在黄曲霉,只有在适宜的条件下它才会繁殖代谢,产生黄曲霉毒素。模拟发酵实验表明,普洱茶的晒青原料接种产毒黄曲霉,在发酵过程中,虽然发酵初期黄曲霉能在茶样中生长繁殖,但在发酵后期黄曲霉的生长明显受到抑制,其数量逐渐下降,发酵终止时,生长在普洱茶中的黄曲霉最终不产黄曲霉毒素。

  参考文献
  李亚莉,康冠宏,杨丽源,祝红昆,李治滢,周红杰《普洱茶发酵过程中外源接种黄曲霉产毒研究》

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